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OPTI-MEM進行貼壁細胞培養的實驗方法

發布時間:2021/5/24 11:13:27      閱讀次數:185

 

MEM細胞培養

血清培養基可以提供細胞貼壁需要的一些基質,本文總結了利用無血清培養基OPTI-MEM進行貼壁細胞的脂質體轉染試驗材料,步驟、個人經驗以及問題分析。

貼壁細胞的脂質體轉染

一、實驗材料

1、宿主細胞CHO(貼壁細胞)

2、脂質體LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen 公司)

3、6孔細胞培養 版

4、無血清培養基OPTI-MEM(語純YC-3039A)

5、轉染級質粒

二、實驗步驟

invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000說明書上列舉了24孔、12孔、6孔......板的實驗體系,因為需要轉染的細胞量大,所以一直采用的是6孔版做的轉染。以下是以6孔板為例說明一下我的體系和方法吧!

1、轉染前一天,以合適的細胞密度接種到6孔培養板上。(我的接種密度是3~4*105/ml.)轉染時,細胞要達到90~95%的融合。

2、溶液1:240ul 無血清培養基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well (總體積250 ul)(溫育5min)

3、溶液2:X ul 無血清培養基 + 4 ug 質粒 per well(總體積250 ul)

4、將溶液1與溶液2混合,室溫下置20min。

5、與此同時,將6孔板中的細胞用無血清培養基沖洗細胞兩遍后,加入2ml 無血清培養基。

6、將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中,搖動培養板,輕輕混勻。在37℃,5%的CO2中保溫5~6小時。

7、6小時后,更換含有血清的全培養基,在37℃,5%的CO2中48~72h檢測轉染水平。

8、如果做穩定轉染,換全培養基培養后24h,即可以1:10或更高的稀釋比例(根據細胞的生長情況)接種到新的培養板,加抗生素進行篩選。

三、個人經驗:

我覺得貼壁細胞的脂質體轉染還是很容易的,有了經驗之后,現在做轉染得心應手,轉染前后細胞的形態幾乎不發生變化,幾乎沒有細胞死亡。轉染率很高。以下是個人經驗,與大家分享。

1.細胞的狀態。這點非常重要,不要急于求成,一定要讓細胞處于最佳的生長狀態再做。有文獻說傳代不要超過17代。我總是在細胞復蘇后的3代左右做,那時細胞狀態最好,不要用傳了很多代的細胞去做,細胞的形態都會發生變化了。

2.細胞的融合度。細胞的融合度必須要達到90%才能做,細胞太少,容易死的。

3.無血清培養基OPTI-MEM(YC-3039A)很好用,有條件的話,就用它代替PBS洗細胞兩遍(我曾比較過OPTI-MEM與PBS或無血清的 DMEM,前者的轉染效率確實高)。注意洗的時候要輕,靠邊緣緩緩加入液體,然后不要吹吸細胞,而是轉動培養板讓液體滾動在細胞表面。如果洗的太厲害,細胞又損失一部分,加了脂質體后,細胞受影響就更大了,死亡細胞會增多。

4.加入無血清培養基后5~6小時更換全培養基。無血清培養基培養時間過長,對細胞是有毒性的,這里有血的教訓!

5.轉染的質粒一定純度好、濃度高、無內毒素。濃度不要低于0.35ug/ul。低濃度的質粒,我做的結果都不好。

6.48小時mRNA表達最高;72h蛋白表達最高。

加轉染試劑(Opti-MEM I),細胞就浮起或死亡問題分析?

各位前輩:我想把microRNA轉到成纖維細胞內,用的是語純YC-3039A Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X)和Lipofectamine™ 2000轉的,F在的問題是一加轉染試劑細胞就大量死亡。Opti-MEM和沖洗用的PBS都37度預熱過的。甚至我用無血清的DMEM對照也大量死亡。有時細胞死亡稍微好點,是不是和細胞批次關系更密切,還是有其他原因。

我的實驗操作 :

1 10%血清DMEM接種細胞在24孔板,長至30~50%滿底時進行轉染。

2 lipofectamine2000 0.5ul稀釋于25 ul Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X) (YC-3039A)靜置5分鐘

3 microRNA 10pM 稀釋于25 ul Opti-MEM

4 混勻2和3,加Opti-MEM至500ul。室溫靜置30min。

5 用PBS(室溫)輕輕沖洗培養空,鏡下觀察部分細胞略變圓(或有變圓傾向),但沒什么細胞浮起。吸去PBS,輕輕加入2和3的混合物。鏡下觀察,即刻細胞大量浮起,或細胞攣縮,有細胞死亡傾向。6h后證實細胞大量死亡。但有細胞干死在培養皿底的印跡。不同批次的細胞,死亡情況略有不同。

問題分析:

1.不是說明書上說什么你就做什么,你是有自主意識的。

2.你的細胞加opti-MEM就不好有兩種可能:a。你養的細胞有問題,或者有共生菌,改變培養條件就可能爆發;b。你的細胞對opti-MEM敏感。為什么一定要用opti?你沒有自己的主見嗎?

3.你的轉染有問題。從你的描述來看,你并不是接種后24hr左右立即做轉染,而是讓它長到50%左右,也就是如果不到50%,你也許會長更久,對嗎?——這是轉染實驗的大忌,超過24hr細胞對轉染會不敏感,轉染效率下降。

4. 你轉染時選擇的細胞豐度也沒有太大的問題,但是這個也是具體問題具體對待。像HeLa是絕對要30%左右的,就是這樣48hr后,細胞已經鋪得密密麻麻;就不要想95%了,那樣的細胞只能扔掉,一天換幾次新鮮的培養基也跟不上培養基變黃的速度。需要參考的東西包括你細胞原本的生長速度,對lipo2K的敏感程度(被抑制和毒死的情況,我可以負責任的告訴你lipo2K非常毒,他們的lipo2K是稀釋到33%的產品,他們100%的lipo2K CD是另賣的,其中原因之一就跟毒性有關,沒有多少細胞能耐受),總之要確保你的細胞在24hr長到合適的濃度做轉染,轉染40-48hr后鋪滿孔,或多或少一點點也可。

5. 由于lipo2K毒性很高,如果實在不合適,你應該考慮更換其他的轉染試劑;此外,應該用你的平時養細胞的培養基做轉染,不過記得去除抗生素,另外稀釋lipo2K和質粒的培養基要去血清去抗生素的。

6.無血清細胞處于一種應激狀態,本來就長不好,這時候你投毒,當然更差。lipo2K不是不計較培養基是否有血清嗎,所以在“雙無”培養基稀釋lipo2K 和RNA,形成復合物后可以投到含血清的無抗生素的培養基中。實際上我們轉染用的培養基,double血清含量(普通5%,轉染用10%)。早期lipo 的說明書要求“雙無”,3hr后添加double血清培養基。實際操作發現,也可以直接投入double血清培養基中。

7.無抗生素的原因是,細胞膜被穿孔,抗生素進入直接殺細胞。

經驗推薦:OPTI-MEM與PBS和無血清的 DMEM培養基相比較,語純生物無血清培養基OPTI-MEM的轉染效率比較高,不妨試下

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