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免疫熒光染色服務

發布時間:2021/3/2 17:50:04      閱讀次數:236

免疫熒光技術(Immunofluorescence technique

        1941年,Coons等于首次采用熒光素進行標記而獲得成功。這種以熒光物質標記抗體而進行抗原定位的技術稱為熒光抗體技術(fluorescent antibody technique)。該技術的主要特點是:特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是:非特異性染色問題尚未完全解決,結果判定的客觀性不足,技術程序也 還比較復雜。

 

一、熒光免疫技術的概念:

        免疫熒光技術(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技術,是標記免疫技術中發展最早的一種。將抗原或抗體用熒光素進行標記,標記的抗原或標記的抗體與相應的抗體或抗原反應 后,測定復合物中的熒光素,這種免疫技術稱為免疫熒光素技術。免疫熒光細胞化學分直接法、夾心法、間接法和補體法。

 

二、熒光免疫技術分類:

(1)熒光抗體顯微鏡技術:抗原抗體反應后,利用熒光顯微鏡判定結果的檢測方法。

(2)免疫熒光測定技術: 抗原抗體反應后,利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法

 

三、熒光的產生:

        物質吸收外界能量而進入激發狀態,在回復基態時多余的能量以電磁輻射的形式釋放,即發光,這種光稱為熒光。這種物質,稱為熒光素。由光激發所引起的熒光,為光致熒光;由化學反應所引起的熒光,為化學熒光。

 

四、熒光素的熒光特性:

      (1)停止供能,熒光現象隨即終止

      (2)對光的吸收和熒光的發射具高度選擇性入射光波長<發射光波長

      (3)熒光效率:熒光效率=發射熒光的光量子數 /吸收光的光量子數

      (4)熒光猝滅現象:熒光素的輻射能力減弱

 

五、常見熒光素:

       (1)異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) :FITC純品為黃色或橙黃色結晶粉末,易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構體,其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性與蛋白質結合力等方面都更優良。FITC分子量 為389.4,最大吸收光波長為490~495nm,最大發射光波長為520~530nm,呈現明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年,是目 前應用最廣泛的熒光素。其主要優點是人眼對黃綠色較為敏感,通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。

       (2)四乙基羅丹明 (rhodamine, RB200) :RB200為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精和丙酮,性質穩定,可長期保存。最大吸收光波長為 570nm,最大發射光波長為595~600nm,呈現橘紅色熒光。

        (3)四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC):TRITC為羅丹明的衍生物,呈紫紅色粉末,較穩定。最大吸收光波長為 550nm,最大發射光波長為620nm,呈現橙紅色熒光,與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,可配合用于雙重標記或對比染色。因其熒光淬滅慢,也可用于單 獨標記染色。

        (4)鑭系:鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪(Eu3)、鋱(Tb3)、鈰(Ce3)等的螯合物經激發后也可發射特征性的熒光,其中以Eu3 應用最廣。Eu3螯合物的激發光波長范圍寬,發射光波長范圍窄,熒光衰變時間長,最適合用于分辨熒光免疫測定。

        (5)藻紅蛋白(P-phycoerythrin,PE):PE是在紅藻中所發現的一種可進行光合作用的自然熒光色素,分子量為240kD的蛋白,最大吸 收峰為564 nm,當使用488 nm激光激發時其發射熒光峰值約為576 nm,對于單激光器的流式細胞儀來說,推薦使用585±21nm的帶通濾光片,雙激光器的流式細胞儀推薦使用575±13nm的帶通濾光片。FL2探測器 檢測PE。

        (6)多甲藻葉綠素蛋白 (peridinin chlorophyll protein,PerCP):PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學合成器中發現的,是一種蛋白復合物,分子量約為35kD,最大激發波長的峰值在 490nm附近,當被488nm氬離子激光激發后,發射光的峰值約為677nm。FL3探測器檢測PerCP。

        (7)碘化丙啶( propidium iodide,PI):可選擇性地嵌入核酸(DNA、RNA)的雙螺旋堿基對中。在對DNA染色時,需用RNase對細胞進行處理,以排除RNA對DNA 熒光定量精度的影響。在488nm波長激發下,PI的發射光譜為610-620nm。 FL2探測器檢測PI。

 

常見熒光素的特性:

        (1)FITC:黃色結晶粉末,吸收光:490~495nm,發射光:520~530nm,明亮的黃綠色熒光。

        (2)RB200:橘紅色粉末, 吸收光570nm,發射光595~600nm,橘紅色熒光。

        (3)TRITC:紫紅色粉末,吸收550nm,發射光620nm,橙紅色熒光。

        (4)鑭系:Eu、Tb

        (5)PE:吸收光490~560nm,發射光595nm,紅色熒光。

        (6)其它:酶作用后產生熒光物質。

 

酶作用后產生熒光物質:

底物

產物

激發光

發射光

B-G

MUG

MU

360

450

AP

MUP

MU

360

450

HRP

HPA

二聚體

317

414

 

        酶作用后產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應,一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。例如,4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解 成4-甲基傘酮,后者可發出熒光,激發光波長為360nm,發射光波長為450nm。其他如堿性磷酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對 羥基苯乙酸等。鑭系螯合物 某些3價稀土鑭系元素如銪 (Eu3+)、鋱 (Tb3+) 等的螯合物可發射特征性的熒光,而且激發光波長范圍寬、發射光波長范圍窄、熒光衰變時間長,最適合于時間分辨熒光免疫測定。

 

六、合適熒光素的選擇:

         (1)具有與蛋白質形成共價鍵的化學基團。

         (2)熒光效率高,標記后下降不明顯。

         (3)熒光色澤與背景色澤對比鮮明。

         (4)標記后能保持生物學活性和免疫活性

         (5)標記方法簡單、快速。

         (6)安全無毒


 

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